高靈敏化學發光檢測試劑盒（ECL）

ECL Reagent是一種基于Luminol的高靈敏性、非放射性化學發光底物，用于檢測免疫印跡中固定在膜上的標記有辣根過氧化物酶（HRP）的蛋白，可檢測pg級的抗原。Luminol在酶的催化作用下發生氧化降解，在增強劑的作用下發射波長為428nm的極-強的光信號，持續時間長、穩定性高、檢測方便。

其原理是，蛋白質或核酸電泳分離后轉印到膜上，以一抗及HRP標記的二抗結合膜上的目的蛋白，或以HRP標記的探針直接或間接結合膜上的核酸。洗膜后用本產品配制的ECL工作液，在室溫下孵育膜1分鐘，將印記膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒中，然后暗室中將X光膠片壓在膜上曝光數秒至數分鐘。顯影定影后蛋白質或核酸條帶可清晰顯示在X光膠片上。也可不進行X光膠片曝光，而直接對印記膜進行熒光CCD掃描。光信號支持重復曝光，也可洗膜脫抗體后供再次檢測。

使用方法

1. 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作，將轉印好的膜從轉膜裝置上卸下來，并用封閉劑封閉膜上的非特異結合位點，室溫下搖晃封閉1小時或2-8℃靜置封閉過夜。

  ※注意：封閉非常重要。

2. 棄封閉液，加入一抗工作液，室溫下搖晃孵育1小時或2-8℃靜置孵育過夜。（抗體孵育濃度：一抗100～500ng／mL，二抗10～50ng／mL）。

3. 用洗膜緩沖液漂洗膜2次，然后用充分體積的洗膜緩沖液洗膜3-6次，每次5分鐘。

4. 用標記HRP的二抗工作液室溫下孵育1小時。

5. 重復步驟3，*洗掉沒有結合的二抗。

6. 將試劑A和試劑B按1:1的比例混合成ECL工作液，根據每平方厘米膜使用0.1-0.2mL的量配制工作液，用ECL工作液充分覆蓋膜后室溫孵育1分鐘。

  ※注意：ECL工作液需現配現用，室溫下放置不能超過1小時。

7. 用平頭鑷鉗住膜，垂直置于吸水紙上吸去過量試劑，將膜置于兩層保鮮膜之間，小心趕走膜與保鮮膜之間的氣泡。

8.  將膜吸附蛋白的面朝上置于暗盒中，于暗室中，取出膠片覆于膜表面，第一次曝光60秒，之后根據結果調整曝光時間。

  ※注意：確保膜和保鮮膜上多余的液體已移除，曝光過程中要保持膠片干燥。

9. 取出膠片在顯影液和定影液中顯影。如果信號太強，減少曝光時間或脫掉抗體后降低抗體濃度重新孵育。

10. 在孵育后的初5-30分鐘內發光*，發光長可持續數小時，但隨著時間的推移光信號減弱。

  ※注意：膜與膠片之間的移動，將影響圖片效果，造成干擾。