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膠原酶I型來源于溶組織梭菌,是一種酶粗提物

發(fā)布時(shí)間: 2022-06-14  點(diǎn)擊次數(shù): 1591次

膠原酶I型來源于溶組織梭菌,是一種酶粗提物


膠原酶(Collagenase)是一種肽鏈內(nèi)切蛋白酶,能特異性的識(shí)別Pro-X-Gly-Pro序列(該序列較多出現(xiàn)在膠原中)并切割該序列中性氨基酸(X)和甘氨酸(Gly)之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽,但膠原酶是唯-一可以降解廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)的具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶。



本品來源于溶組織梭菌,是一種酶粗提物,能夠降解天然膠原和網(wǎng)狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等,分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白,多糖和脂質(zhì),非常適用于組織消化。


膠原酶常根據(jù)活性的差異,分為四種類型:膠原酶I型、II型、III型和IV型,在應(yīng)用范圍上有所不同。1)膠原酶I型(Type I Collagenase):含有比較均勻的各種酶活力(包括膠原酶,酪蛋白酶,梭菌蛋白酶,胰蛋白酶活性)。通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備;2)膠原酶II型(Type II Collagenase):含有更高的梭菌蛋白酶活性,通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細(xì)胞的制備;3)膠原酶III型(Type III Collagenase):含有較低的蛋白酶活性,常用于乳腺細(xì)胞的制備;4)膠原酶IV型(Type IV Collagenase):含有低胰酶活性,通常用于胰島細(xì)胞的制備,或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。


1. 膠原酶儲(chǔ)存液的配制

向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS(Hank’s平衡鹽溶液,含Ca2+、Mg2+),輕輕旋渦震蕩使其充分溶解,制備成1g/ml(即1000×)的儲(chǔ)存液。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22μm的濾膜過濾除菌,分裝成小份量,然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍,避免反復(fù)凍融。其用于組織和細(xì)胞分散的常用濃度為:0.5-2.5mg/ml,用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml,需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)條件或者參考相應(yīng)的文獻(xiàn)資料確定所需的佳工作濃度。


2.組織的分離

1)使用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊;

2)利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次;

3)加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS,使其浸沒組織塊,并加入膠原酶至需要工作濃度;

4)于37℃孵育4-18h。消化時(shí)使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補(bǔ)充消化可以提高消化效率。

5) 已分散開的細(xì)胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得,收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育;

6)利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次;

7)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞,利用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度;

8)于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。




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