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一、測(cè)定原理

Fenton反應(yīng)是zui常見(jiàn)的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng)，H2O2的量和Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH.量成正比，當(dāng)給予電子受體后，用griess試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與OH.的多少呈正比關(guān)系。

二、試劑組成與配制：（50T/48樣）

試劑一：3%H2O2標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5ml×1支，4℃保存3個(gè)月。0.03%標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液的配制：3%H2O2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：蒸餾水=1：99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

試劑二：底物儲(chǔ)備液1ml×1支，4℃保存3個(gè)月。

試劑三：甲液儲(chǔ)備液2ml×1支，4℃保存3個(gè)月，用時(shí)加蒸餾水1：9稀釋成應(yīng)用液。
乙液7ml×2支，4℃保存3個(gè)月。

試劑三應(yīng)用液的配制：甲液應(yīng)用液與乙液等比例混合，用多少配多少，余下4℃保存。

試劑四：液體10ml×1瓶，用時(shí)加蒸餾水稀釋至100ml，制備成應(yīng)用液，4℃保存。若有結(jié)晶，則放置37℃水浴至全部溶解后再稀釋。

試劑五：液體30ml×1瓶，避光4℃冰箱保存.

試劑六：液體30ml×1瓶，避光4℃冰箱保存.

試劑七：分析純的冰乙酸（冰醋酸）自備。

顯色劑的配制：試劑四應(yīng)用液：試劑五：試劑六：冰乙酸=8：3：3：2，需多少配多少，現(xiàn)用現(xiàn)配。

注：抑制羥自由基的物質(zhì)如：血清（漿）、各種組織勻漿液、口服液等；

產(chǎn)生羥自由基的物質(zhì)如：中性白細(xì)胞、某些藥物、部分植物等。

三、操作：

以上配制好的應(yīng)用液，先37℃水浴中預(yù)溫3分鐘，以下操作在37℃水浴中進(jìn)行。


*：參考取樣量：血清(漿)樣本用生理鹽水20倍稀釋后取0.2ml作檢測(cè)；若您有微量移液器，可直接取0.010ml

血清（漿），再加0.190ml生理鹽水。組織勻漿上清，取0.2ml檢測(cè)。具體取樣量需您自己做預(yù)試確定，詳細(xì)預(yù)試方法見(jiàn)附錄。

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四、計(jì)算公式：

1、血清計(jì)算公式：

定義：規(guī)定每毫升血清（漿）在37℃下反應(yīng)1 分鐘，使反應(yīng)體系中H2O2 濃度降低1mmol/L

為一個(gè)抑制羥自由基能力單位。

抑制羥自由基能力（U/mL）=(對(duì)照OD 值-測(cè)定OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品

濃度（8.824mmol/L）×(1mL/取樣量) ×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

2、組織計(jì)算公式

定義：規(guī)定每毫克組織蛋白在37℃下反應(yīng)1 分鐘，使反應(yīng)體系中H2O2 濃度降低1mmol/L 為

一個(gè)抑制羥自由基能力單位。

抑制羥自由基能力（Uprot）=(對(duì)照OD 值-測(cè)定OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)

準(zhǔn)品濃度（8.824mmol/L）÷[待測(cè)樣本蛋白濃度（mgprot/mL）×取樣量（0.2mL）]


3、產(chǎn)生羥自由基能力的計(jì)算公式：

定義：規(guī)定每毫升或每毫克物質(zhì)或每立方厘米內(nèi)106 個(gè)細(xì)胞在本反應(yīng)體系中使反應(yīng)液中H2O2

濃度增加1mmol/L 為一個(gè)抑制羥自由基能力單位。

抑制羥自由基能力（U/mL）=(測(cè)定OD 值-對(duì)照OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品

濃度（8.824mmol/L）×(1mL/取樣量) ×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

五、注意點(diǎn)：

1.       必須每一支管子單獨(dú)做，并且反應(yīng)時(shí)間一分鐘一定要準(zhǔn)確。

2.       必須嚴(yán)格按照操作表順序加試劑，不可配制混合試劑。

3.       檢驗(yàn)樣本溶劑或介質(zhì)可為生理鹽水、蒸餾水、醋酸、無(wú)水乙醇，但不能為磷酸緩沖液。

4.       此法檢測(cè)靈敏度較高，檢測(cè)血清（漿）和組織以外樣本時(shí)，先取原液及不同濃度稀釋后的樣本，

例如5倍稀釋液或10倍稀釋液做預(yù)試。如測(cè)定管顏色太淺可將樣本用其溶劑繼續(xù)稀釋至顏色深為止。

我所曾檢測(cè)花粉的水提液的活性氧，將其原液稀釋150倍后，顯色較好。

 

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