質粒是真核細胞細胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌

細胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸分子。現(xiàn)在習慣上用來專指細菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細胞核或擬核中的 DNA 以外的DNA 分子。在基因工程中質粒常被用做基因的載體。質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進細菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的 DNA 分子。質粒在宿主細胞體內(nèi)外都可復制。(Vector)(DNA)

目前，已發(fā)現(xiàn)有質粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細菌質粒都是共價閉合環(huán)狀 DNA 分子(簡稱 cccDNA)。細菌質粒的相對分子質量一般較小，約為細菌染色體的 0.5%～3%。根據(jù)相對分子質量的大小，大致上可以把質粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質量是 40×10⁶ 以上，較小一類的相對分子質量是 10×10⁶ 以下(少數(shù)質粒的相對分子質量介于兩者之間)。每個細胞中的質粒數(shù)主要決定于質粒本身的復制特性。按照復制性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細胞內(nèi)只有1～2個質粒；另一類是松弛型質粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞內(nèi)一般有 20 個左右質粒。這些質粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含有 10-200 份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成還會使質粒拷貝數(shù)增至幾千份。

質粒提取原理

現(xiàn)在較常用的質粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質粒（＞15Kb）。

堿裂解法是一種廣泛使用的制備質粒 DNA 的方法。其原理為：染色體 DNA 遠遠大于質粒 DNA，染色體 DNA 為線狀分子，而質粒為共價閉合環(huán)狀分子。當 pH 12.0-12.6 堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體 DNA *變性，而共價閉環(huán)質粒 DNA 在將 PH 調至中性后即可以恢復其天然構象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體 DNA 和蛋白質在去污劑 SDS 的作用下形成沉淀，而質粒 DNA 仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體 DNA、RNA 及蛋白質，質粒 DNA 仍在上清中。

質粒提取常見問題分析

1、影響質粒提取的因素有哪些？

質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細菌細胞的裂解、質粒拷貝數(shù)、質粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。

2、為什么從革蘭氏陽性菌中提取質粒要在懸浮液中加入溶菌酶？

革蘭氏陽性菌有一層細胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。

3、如何根據(jù)實驗需要選擇不同級別的產(chǎn)品？

從純度上：各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉化，普通純度的質粒可以滿足要求；而對于轉染實驗，則要求使用高純度質粒提取試劑盒方能滿足要求。

從提取的量上：1-20μg，應選擇小量提取試劑盒；20-40μg，應選擇中量提取試劑盒；大于 40μg，應選擇大量提取試劑盒。

從宿主菌上：分為普通細菌質粒提取試劑盒、G+菌質粒提取試劑盒和酵母菌質粒提取試劑盒，根據(jù)情況進行選擇。

■ 未提出質粒或質粒得率較低：

△ 大腸桿菌老化

請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。

△ 質粒拷貝數(shù)低

由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質粒 DNA 提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

△ 菌體中無質粒

有些質粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

△ 堿裂解不充分

使用過多菌體培養(yǎng)液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液 1、2 和 3 的用量。對低拷貝數(shù)質粒，提取時，可加倍使用溶液 1、2 和 3，可能有助于增加質粒提取量和質粒質量。

△ 溶液使用不當

溶液 2、3 在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應置于 37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

△ 吸附柱過載

不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如 TB 或 2×YT，菌液體積必須減少；若質粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長率，則需調整 LB 培養(yǎng)液體積。

△ 質粒未全部溶解（尤其質粒較大時）

洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

△ 乙醇殘留

漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。

△ 洗脫液加入位置不正確

洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會*覆蓋硅膠膜的表面達到大洗脫效率。

△ 洗脫液不合適

DNA 只在適當 pH 值的低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液 TE (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水；洗脫效率取決于 pH 值。大洗脫效率在 pH 7.0–8.5 間。當用水洗脫時確保其 pH 值在此范圍內(nèi)，如果 pH 過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使更用有利于提高洗脫效率。

△ 洗脫體積太小

洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

△ 洗脫時間過短

洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置一分鐘可達到較好的效果。

■ 質粒質量不高：

△ 混有蛋白

不要使用過多菌體。溶液 1、2、3 處理并離心后溶液應為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進行下一步驟。 △ 混有 RNARNase A 處理不*，請減少菌體用量或加入溶液 3 之后室溫放置一段時間。如果溶液 1 已保存 6 個月以上，請在溶液 1 中添加 RNaseA。

△ 混有基因組 DNA

加入溶液 2 和 3 后應溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組 DNA 剪切成碎片從而混雜在質粒中。如果加入溶液 2 后過于粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量。細菌培養(yǎng)時間過長會導致細胞和 DNA 的降解，不要超過 16 小時。

△溶液 3 加入時間過長

溶液 3 加入后，放置時間不要太長，否則有可能會產(chǎn)生小片段 DNA 污染。

△ 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在質粒提取過程中降解質粒 DNA，影響提取質粒 DNA 的完整性，選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和 *0。

△ 裂解時間過長

加入溶液 2 后裂解時間不應超過 5 分鐘。

△ 質粒的二聚體和多聚體形式

質粒復制過程中形成的，與宿主菌相關，電泳可檢測出。