PCR法支原體檢測試劑盒*了，歡迎！

《PCR法支原體檢測試劑盒》

儲存條件
該產(chǎn)品在常溫下運(yùn)輸，收到產(chǎn)品后，請立即放-20 ℃冰箱低溫保存。該條件下，至少2年內(nèi)有效。
產(chǎn)品用途
《PCR法支原體檢測試劑盒》可用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：（1）體外細(xì)胞培養(yǎng)的上清；（2）血清；（3）各種體液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；（4）別的液體樣品。本產(chǎn)品僅供研究使用。
產(chǎn)品簡介
哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細(xì)胞的所有參數(shù)，導(dǎo)致實驗結(jié)果的不準(zhǔn)確、甚至*錯誤。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細(xì)胞培養(yǎng)都要進(jìn)行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。
培養(yǎng)法是相對可靠的支原體檢測技術(shù)，但是該方法非常耗時的，需要數(shù)周，不適合作為細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測。此外，通過固體培養(yǎng)法無法檢測污染細(xì)胞的一種zui常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。
有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，當(dāng)檢測成陽性時，細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。
目前，細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體污染的檢測通常使用的是PCR法。但是PCR法也有明顯的缺點：（1）整個過程大約需要3個小時；（2）由于細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)天后，培養(yǎng)液中經(jīng)常含有嚴(yán)重抑制PCR擴(kuò)增的代謝物，所以樣品的前處理一般是PCR法*的環(huán)節(jié)；（3）PCR法的靈敏度有限，通常需要將培養(yǎng)液離心濃縮或者抽提DNA后再檢測；（4）PCR產(chǎn)物的電泳，需要用到EB等潛在的致癌物質(zhì)；（5）需要用到PCR儀、電泳槽、凝膠成像儀、離心機(jī)等儀器。

PCR法支原體檢測試劑盒*了

本公司已經(jīng)開發(fā)出了于體外細(xì)胞培養(yǎng)的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》，與PCR法支原體檢測相比，其具有許多優(yōu)點：耗時短、靈敏度高、操作簡單、不會被細(xì)胞代謝產(chǎn)物抑制、結(jié)果無需電泳肉眼可直接判斷等。
盡管如此，《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》可能也有個小缺點：因為《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》需要至少同時使用4條引物才能完成擴(kuò)增，其引物設(shè)計相對困難。雖然經(jīng)我們測試，該試劑盒至少可認(rèn)識其說明書中列舉的13種支原體，而這13種支原體大約占污染細(xì)胞的支原體種類的99%左右。但是，不排除《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》無法識別個別在體外細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)概率極低的支原體。為此，我們特意開發(fā)了具有廣譜識別能力的《PCR法支原體檢測試劑盒》作為補(bǔ)充。此外，單獨(dú)使用目前市面上的任何一種支原體檢測試劑盒，都無法做到100%正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。嚴(yán)格的支原體檢測，至少需要使用兩種，做好使用三種不同原理的支原體檢測方法同時進(jìn)行檢測，才能使檢測結(jié)果接近100%正確。
如果您想得到100%正確的支原體檢測結(jié)果，同時使用本公司生物試劑的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》和《PCR法支原體檢測試劑盒》進(jìn)行檢測，將會得到比較滿意的結(jié)果。
試劑盒組成

• 支原體引物和內(nèi)參（100次）：206 μL
• 陽性支原體DNA：50 μL

• 注意1：本試劑盒提供的支原體引物和內(nèi)參可供至少100次支原體檢測使用。
• 注意2：以下試劑需要自己準(zhǔn)備：（1）滅菌的去離子水；（2）普通的Taq DNA 聚合酶和相應(yīng)的緩沖液；（3）2.5 mM的dNTP；（4）6× DNA上樣緩沖液。

檢測過程:

• 待測樣品的準(zhǔn)備

為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，待測的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品來源于至少培養(yǎng)3天且匯合度在70-90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)液上清（貼壁細(xì)胞）。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后，至少讓細(xì)胞生長3天再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測。取150 μL上述待測樣品，在普通臺式離心機(jī)上1200 rpm (大約150-200 g)離心5 min，取離心后的上清100 μL用于支原體檢測，丟棄下層剩余的50 μL（含細(xì)胞沉淀）。收集并已經(jīng)離心去除細(xì)胞的待測樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個月，在-80℃基本可以保存。

• 注意：本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細(xì)胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴(yán)格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動物細(xì)胞將被沉淀下來而支原體不會。如果錯誤使用更高的離心力將可能導(dǎo)致支原體也被離心下來，從而導(dǎo)致假陰性。

• PCR體系的配制

請按下表（表1）進(jìn)行PCR體系（總體積25 μL）的配制:
 
    表1.PCR擴(kuò)增體系的配制

• PCR設(shè)置參數(shù)

1 cycle      94 ℃ for 2 minutes
35 cylses    94 ℃ for 20 seconds
             55 ℃ for 20 seconds
             72 ℃ for 45 seconds
1 cycle      72 ℃ for 5 minutes
1 cycle       8 ℃ for ∞
 

• PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

• 配制1.5%含溴化乙錠的DNA瓊脂糖凝膠。
• 往每個PCR管內(nèi)加入5 μL 6× DNA上樣緩沖液。
• 取上述含DNA上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
• 當(dāng)溴酚藍(lán)染料跑出3厘米左右時，停止電泳，拍照。

結(jié)果判斷
    PCR擴(kuò)增的結(jié)果有可能出現(xiàn)以下幾種情況（表2）：
    表2. PCR擴(kuò)增的可能結(jié)果

    注：“-”代表沒有條帶；“+”代表有條帶；“+”號越多代表條帶越強(qiáng)。

圖1. 支原體PCR擴(kuò)增結(jié)果。586 bp條帶為內(nèi)參條帶，270 bp左右的條帶為支原體特異條帶（各支原體的條帶大小會略有不同，總體在260-280 bp）。隨著支原體DNA模板的增加，270 bp左右的條帶會逐漸增強(qiáng)而586 bp的內(nèi)參條帶會逐漸減弱，甚至消失。泳道1：陰性對照或者沒有支原體污染的樣品；泳道2：極重度支原體污染樣品；泳道3：重度污染樣品；泳道4：中度污染樣品；泳道5：輕度污染樣品；泳道6：PCR的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。M：DNA marker.
注意事項

• 每次檢測都應(yīng)該設(shè)有陰性對照，作用有：（1）由于有效的PCR擴(kuò)增，陰性對照也會有一條586 bp的內(nèi)參條帶，這樣可以保證本試劑盒含有的支原體引物和內(nèi)參以及自己準(zhǔn)備的Taq DNA 聚合酶，dNTP等試劑沒有問題；（2）只有當(dāng)陰性對照的結(jié)果沒有出現(xiàn)270 bp左右的支原體特異條帶時，別的樣品的結(jié)果才是可信的。
• 如果586 bp條帶和270 bp左右的條帶都沒有出現(xiàn)（如圖1，泳道6），在排除PCR試劑的問題后（即陰性對照可以正常擴(kuò)增），說明該樣品含有抑制PCR擴(kuò)增的代謝產(chǎn)物。有關(guān)PCR的擴(kuò)增會被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制的問題，Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（貨號MP0035）的PCR法支原體檢測試劑盒說明書中也特別提到了這點，說明這是一個PCR法支原體檢測中經(jīng)常遇到的問題，其強(qiáng)烈建議用試劑盒進(jìn)行DNA提取后再進(jìn)行鑒定。這也是PCR法支原體檢測的致命弱點。為了克服該問題，以下問題必須注意：（1）您購買的PCR法支原體檢測試劑盒，其擴(kuò)增產(chǎn)物中必須含有內(nèi)參（Internal Contol）條帶作為對照【本試劑盒的586 bp條帶就是內(nèi)參條帶】。否則，如果沒有內(nèi)參作為對照，即使樣品擴(kuò)增后沒有支原體特異條帶，你也無法確定是因為樣品確實沒有支原體還是因為PCR被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制導(dǎo)致的假陰性。（2）如果出現(xiàn)PCR的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制時，請使用血液基因組DNA抽提試劑盒，抽提支原體DNA后再進(jìn)行PCR鑒定。（3）同時使用本公司生物試劑的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》進(jìn)行檢測，經(jīng)嚴(yán)格測試，該試劑盒的擴(kuò)增不會被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制。
• 本試劑盒與Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（貨號MP0035）的設(shè)計原理一樣，可以替代后者用于各類支原體的檢測。
• 根據(jù)支原體DNA的序列，本試劑盒可以識別所有100多種至今已發(fā)現(xiàn)的支原體，具有廣譜的識別能力。
• 如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染，本公司提供細(xì)胞支原體清除和預(yù)防試劑。

PCR法支原體檢測試劑盒*了